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答：Klentaq 是 Taq 的截短版本，缺少酶的 5'>3'-外切核酸酶結(jié)構(gòu)域。Klentaq 提高了保真度，并且比 Taq 更耐熱、更堅(jiān)固。Omni Klentaq 與 Klentaq 的保真度沒有受到影響。Cesium Klentaq 的保真度略高于 Klentaq。其余突變酶的保真度尚未*確定。
與*級(jí)商業(yè) Taq 相比，我們的突變酶的敏感性不會(huì)因犧牲其特殊的抑制抗性或冷敏感性特征而受到損害，并且允許從人類 DNA 中檢測單基因拷貝。對于高產(chǎn)量擴(kuò)增，Klentaq 酶通常需要比 Taq 更長的延伸時(shí)間，我們建議每個(gè) 1 kb DNA 靶標(biāo)延伸 3-4 分鐘。
答：“LA”代表“長而準(zhǔn)確”。LA 酶與校對器混合，并以更好的保真度執(zhí)行。此外，它們是長 DNA 靶標(biāo)的優(yōu)選酶，它們的表現(xiàn)異常出色。此外，它們通常更穩(wěn)健，因此短目標(biāo)擴(kuò)增也可以從中受益。
*關(guān)于長靶點(diǎn)的提示：對于純化的 DNA 模板，考慮酶濃度至少為 0.1 ul/1 kb 靶點(diǎn)/50-100 ul 反應(yīng)體積，并允許每 1 kb 靶點(diǎn)有 3-4 分鐘的延伸時(shí)間。對于粗制樣品，可能需要更多的酶，具體取決于抑制水平（強(qiáng)烈建議使用酶滴定法）。考慮包括我們的 PEC 增強(qiáng)劑。
答：我們的新型酶是 Taq DNA 聚合酶的突變體，經(jīng)過特別挑選，因?yàn)樗鼈儗V泛使用的強(qiáng)效 PCR 抑制劑具有高度抗性，例如全血、血清、血漿、尿液、腐殖酸、膽汁鹽、植物組織提取物、各種食品相關(guān)抑制劑、GITC、乙醇等。因此，這些酶可以在大多數(shù)商業(yè) Taq 產(chǎn)品無法執(zhí)行的水平上耐受 PCR 中的此類抑制劑。Taq 突變體的這一*功能允許對各種臨床、環(huán)境和法醫(yī)原始樣品進(jìn)行直接 PCR，從而跳過 DNA 提取步驟。我們的 PCR 增強(qiáng)劑雞尾酒 (PEC) 專為大多數(shù)抑制性粗制 PCR 樣品配制，可進(jìn)一步提高反應(yīng)對抑制劑的耐受性。此外，我們的一些 PEC 旨在幫助處理困難的、富含 GC 的目標(biāo)。
答：我們*的突變 Taq 酶選擇，對各種強(qiáng)效 PCR 抑制劑具有耐受性，連同我們的 PCR 增強(qiáng)劑，可實(shí)現(xiàn)各種直接 PCR 應(yīng)用，在許多情況下跳過 PCR 之前的 DNA 提取。酶/增強(qiáng)劑的選擇取決于抑制物質(zhì)的類型和濃度、qPCR 檢測的類型、熱啟動(dòng) PCR 依賴性、模板的 GC 含量和其他因素。請參閱表格“哪種酶適合我”和“哪種增強(qiáng)劑適合我”。
答：我們所有的酶都非常適合嵌入染料，例如 SYBR Green。實(shí)際上，它們對 SYBR Green 的抗性比野生型 Taq 高 2-3 倍（這種染料在 1X 以上濃度時(shí)對普通 Taq 的 PCR 有抑制作用），這使它們在 qPCR 中具有一定的優(yōu)勢，特別是在一些熒光淬滅的反應(yīng)中.
對于 TaqMan 檢測，我們只推薦我們的全長 Taq 突變體（OmniTaq 系列或 CesiumTaq），但不推薦 Klentaq 突變體，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈η懈?TaqMan 探針?biāo)璧?5'>3'- 核酸外切酶活性。
提示：對于復(fù)雜/抑制性 qPCR 樣品，全長 Taq 和 Klentaq 酶的 1:1 混合物可能比單獨(dú)使用全長酶效果更好。（Klentaqs 通常更堅(jiān)固，半量的全長 Taq 酶足以用于探針切割）。如果你想試試這個(gè)，兩個(gè)緩沖區(qū)也應(yīng)該以相同的比例混合。
注意：我們的酶的 LA 版本不是適合 TaqMan 檢測的，因?yàn)樗鼈兙哂行ζ骰钚浴?/span>
答：我們建議您選擇 Omni Klentaq、Omni Klentaq 2、OmniTaq 或 OmniTaq 3，必要時(shí)與 PEC 結(jié)合使用。我們強(qiáng)烈建議對此類粗樣品進(jìn)行酶滴定，因?yàn)楦嗟拿赣兄诟嗟难骸Ｕ堄涀。簶颖镜淖罴衙噶靠赡苓h(yuǎn)遠(yuǎn)超過純化 DNA 樣本的最佳酶量，過量的酶可能導(dǎo)致過度擴(kuò)增。通常推薦使用純化 DNA 的酶量減少 5-10 倍。如果更高量的酶（至少 1 ul/25 ul 反應(yīng)）不能令人滿意，您可以加入 PEC 增強(qiáng)劑以進(jìn)一步增強(qiáng)血液抵抗力。我們不建議您將 PEC 用于您的純化 DNA，除非目標(biāo)是富含 GC 且堅(jiān)韌的。
您也可以使用我們用這些酶配制的 5X PCR 試劑盒（提供方便，但限制了滴定酶的選擇）。
根據(jù)循環(huán)條件，我們建議您使用針對目標(biāo)優(yōu)化的 PCR 方案進(jìn)行兩個(gè)更改： A. 在 94-95 度下引入更長的初始加熱步驟，即 8-10 分鐘。在騎自行車之前，以及 B. 延長時(shí)間的兩倍或三倍。請注意：如果您使用 PEC 增強(qiáng)劑，請記住它可能會(huì)將您的最佳退火溫度降低幾度。
注意：在為您的應(yīng)用選擇合適的酶后，同樣的注意事項(xiàng)也適用于其他抑制性粗樣品。
答：是的，在協(xié)議中進(jìn)行了一些簡單的更改。我們的新型酶在 PCR 中可以抵抗高達(dá) 40% 的血液。因此，在血液的 qPCR 中，擴(kuò)增應(yīng)該沒問題（如果你想在瓊脂糖凝膠中運(yùn)行它們，你應(yīng)該看到預(yù)期的產(chǎn)品）。然而，qPCR 中擴(kuò)增產(chǎn)物的光學(xué)檢測的并發(fā)癥源于血紅素的熒光猝滅效應(yīng)。如果您使用 SYBR Green，解決此問題的方法是簡單地將輸入染料濃度提高到 20-30 X（對于 5-10% 的血液），甚至更高，具體取決于血液濃度。這將補(bǔ)償淬滅效應(yīng)，并減少背景。
如果您使用 TaqMan 檢測，同樣由于血液的淬滅作用，我們建議將熒光探針濃度提高到 400-500 nM，并且不超過 4-5% 的血液。
注意：如果您擴(kuò)增血清、血漿或其他非淬滅粗樣品，則無需更改這些方案。
答：有些 DNA 提取試劑盒不能*去除起始材料中的 PCR 抑制劑，例如血液或植物組織成分或腐植酸，甚至?xí)胍恍┮种苿缥⒘康谋椒印⒙确隆⒘蚯杷犭一蛞掖肌Ｔ谧屑?xì)滴定酶后，可以通過使用我們的 Taq 抑制劑抗性突變體來消除這個(gè)問題。（與粗制 PCR 樣品相比，這對我們的酶來說應(yīng)該是一項(xiàng)相對“容易”的工作，并且您必須確保您不會(huì)過量使用酶）。
答：我們的冷敏感酶，例如 Cesium Taq、Cesium Klentaq AC 和 Cesium Klentaq C，在低溫下表現(xiàn)出抑制的活性，而在 65 度以上時(shí)它們變得*活躍，因此在 PCR 中具有內(nèi)在的熱啟動(dòng)性能。與涉及抗 Taq 抗體或酶化學(xué)修飾的熱啟動(dòng) Taq 配方不同，它們不需要對循環(huán)條件進(jìn)行任何更改。
答：一些 Taq 制造商提供的酶單位濃度是由傳統(tǒng) DNA 聚合酶活性測定法的略微修改版本確定的，該測定法是早期為非熱穩(wěn)定性 DNA 聚合酶開發(fā)的。該測定基于相對簡單和“容易”的反應(yīng)，僅測量核苷酸在 72 度下?lián)饺霂锌诘?DNA 中，不考慮 PCR 條件下重要的酶質(zhì)量，例如熱穩(wěn)定性和持續(xù)合成能力。因此，它本身不是 PCR 檢測，并且不提供實(shí)際的“PCR 單位”。因此，它可能無法顯示和預(yù)測 PCR 中真正的酶性能。因此，我們與其他制造商一樣，相信為每個(gè)反應(yīng)提供推薦的酶量對于最終用戶來說更加可靠和實(shí)用。
[實(shí)際上，這張表只有答案，沒有問題。]
Klentaq1 是 Taq DNA 聚合酶的 Klenow 片段類似物。它是已知的最熱穩(wěn)定的 Taq 形式，它沒有任何外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶，并且其晶體結(jié)構(gòu)是已知的 [4]。
LA PCR 是長而準(zhǔn)確的 PCR [1]。
根據(jù)美國 5,436,149，后綴 LA 表示已混入少量校對酶。
KlentaqLA (KTLA) 或 TaqLA 或 TthLA 是高溫下進(jìn)行長 DNA 延伸的最佳酶，例如引物定向誘變、長 PCR 或高保真 PCR，或用 PCR 產(chǎn)物引發(fā)（大引物）。（這些“酶”實(shí)際上是混合物，美國 5,436,149，由 Wayne Barnes 發(fā)明，現(xiàn)在由日本 Takara BIO, Inc. 所有）。
- 觀看此空間以了解我在保真度方面的改進(jìn)。
- TaqLA 由 Boehringer-Mannheim 出售為“Expand”，Takara Shuzo 出售為“ExTaq for LA PCR”，Life Technologies 出售為“Elongase”。
- Perkin Elmer 以“Tth XL”出售 TthLA，Clontech 以“Advantage Tth”出售 - Stratagene 的“TaqPlus”和“Taq Extender”也申請了美國 5,436,149。
“LA 技術(shù)”是將兩種耐熱酶混合在一起以獲得更長、更準(zhǔn)確（更高保真度）的 DNA 延伸的概念，通常用于 PCR。由 Wayne M. Barnes、美國 5,436,149 和國外同行發(fā)明。該現(xiàn)在歸 Takara Shuzo 所有
以下兩種推薦的緩沖液都假定您添加的 dNTP 和它們自己的（等摩爾）鎂。如果您要添加 250 uM 每個(gè) dNTP，請?zhí)砑宇~外的 1 mM 鎂（最終 3.5 mM）以實(shí)現(xiàn)此目的。
我們通過儲(chǔ)備 10 mM 每個(gè) dNTP、40 mM MgCl2（“10/40”）來做到這一點(diǎn)。然后，以下緩沖液將在 1X 時(shí)提供最佳的“過量”鎂。[您可能更愿意在下面添加額外的 10 mM MgCl2，然后添加不含 Mg
的 dNTP。] Tris-HCl 原液由 Trizma Base 和 HCl 制成，濃度為 1 M Tris。然而，在室溫下以 50 mM 在其他普通水中讀取 pH 值。
* Klentaq1、KlentaqLA 和 Taquenase 的 10xKLA 為
* 500 mM Tris-HCl pH 9.2；160 mM 硫酸銨；25 毫米氯化鎂；1% 吐溫 20。
* Taq 和 TaqLA 的 10xTLA 相同，但只有 7.5 mM MgCl2。
* 包括用于高 GC 目標(biāo)和多重 PCR 的最終 1.3 M 甜菜堿。還將加熱步驟減少到 92-93 度。C. [從參考修改。2 & 5]
我們的“基準(zhǔn)強(qiáng)度”Klentaq1、KTLA 和 TAQUENASE 相當(dāng)于 wt Taq 的活性，如果它們用于 2 kb 的擴(kuò)增。也就是說，0.1 ul 正好適合 50 ul 的反應(yīng)大小。（野生型）Taq 的其他供應(yīng)商將此稱為 5 單位/ul；我們稱其為“5 個(gè) 2kb-PCR 單元”/ul。更長的目標(biāo)需要更多的 Klentaq1，最大為 0.65 ul/50 ul（目標(biāo)大小為 35 kb；需要 KTLA 而不是 Klentaq1）。對于小于 2 kb 的目標(biāo)，需要更少的 Klentaq1（但 0.1 ul 仍然可以）。
對于 2 kb 以下的 PCR 目標(biāo)，如果延伸溫度降低到 60 度，則需要 1/2 的酶（TaqLA 或 KlentaqLA）。并且延伸時(shí)間有所增加（即從 5' 到 8' 或 10'）。
Klentaq1 適用于短 PCR、RAPD 等。對于循環(huán)測序，它非常出色，但與 Taquenase 相比，它現(xiàn)在是舊技術(shù)。
KlentaqLA 是否在其 PCR 產(chǎn)物上留下鈍端？部分是，部分不是。Klentaq1 確實(shí)添加了額外的 A。然而，要有效地做到這一點(diǎn)，需要一個(gè)額外的最后延長時(shí)間（20-30 分鐘）。混合物中的校對
酶預(yù)計(jì)會(huì)去除這個(gè)額外的 A。哪一個(gè)獲勝可能取決于您的 PCR 反應(yīng)在完成
循環(huán)后得到的確切處理。可能性是
：4度過夜。
灣。25度吃午飯。
C。68度的咖啡。
d。上述任何一項(xiàng)，然后在 25 度時(shí)打個(gè)電話。
e. 上述以外。
- 我是否完成了上述實(shí)驗(yàn)條件，然后檢查了
DNA 的末端？否。
- 我是否將我的產(chǎn)品克隆到平端載體中？是的，在 T4 DNA 聚合酶的鈍端連接過程中使用 1 mM 六氨合氯化鈷和 1 mM DTT。
- 我檢查過整個(gè)克隆位點(diǎn)的閱讀框嗎？不是通過測序。
- 我是否曾經(jīng)將 KlentaqLA 制造的閱讀框關(guān)鍵 PCR 產(chǎn)物克隆到 ORF 的鈍端？是的，根據(jù)編碼產(chǎn)物的酶活性，大約一半的克隆似乎沒有問題。
- 我用過 T 向量嗎？不。
我們有數(shù)據(jù)表明 Taquenase 是循環(huán)測序的最佳酶。它必須與 MnSO4（除了 MgCl2）一起使用以獲得最佳結(jié)果（Barnes，未發(fā)表）。不幸的是，由于和許可問題（見下文），您無法使用它。
1.25 M 甜菜堿（Sigma 編號(hào) B-2629）也是一個(gè)不錯(cuò)的主意，可包含在循環(huán)測序反應(yīng)中 [Barnes，未發(fā)表]
“Taquenase”(tm)是兩種Taq突變體的組合。突變體 1 是 N 端缺失 Klentaq1（美國 5,436,149 和其他國家正在申請中。突變體 2 是由 Stan Tabor [3] 發(fā)現(xiàn)的 F667Y。F667Y 突變允許 ddNTP 減少 100 到 1000 倍才能正常工作。截至 3 月 25 日， 1997 年，這種突變被授予 Tabor & Richardson 并授權(quán)給 Amersham 的美國 5,614,365 涵蓋。因此，除非我們獲得 Amersham 的許可，否則我們無法提供這種酶，這是意料之中的。
我們認(rèn)為沒有涉及循環(huán)測序的（由 M. Craxton, MRC Cambridge, England 發(fā)明），也不是雙脫氧測序（由 Fred Sanger, MRC Cambridge, England 發(fā)明）
。ddNTP 的意思是“雙脫氧 NTPs”或“雙脫氧終止子”。
NTP是指三磷酸核苷，聚合酶的組成部分。它們可以是 ATP、GTP、CTP 或 UTP==TTP。對于 RNA，有時(shí)為了清楚起見會(huì)添加前綴 r，例如 rCTP。對于 DNA，通常會(huì)添加前綴 d，例如 dATP。
雙脫氧是指沒有 OH 基團(tuán)的兩個(gè)位置（2' 和 3' 位置）。
Perkin Elmer 最近將其熒光 ddNTP 的價(jià)格（通過降低濃度）提高了 1000 倍。
DYE-ddNTP 的意思是“DYE 終止劑”或 DYE-雙脫氧終止劑，它會(huì)變得很拗口。它們由 ABI 銷售，但它們最初是由 Dupont 發(fā)明的，可從其子公司 NEN 獲得，或即將推出。
DYE 是指熒光標(biāo)記，由測序儀上的激光束激活。
Klentaq1 是已知的穩(wěn)定的 Taq DNA 聚合酶形式，在 98 或 99 度的加熱步驟中通過 PCR 測試。Taquenase 保持這種熱穩(wěn)定性。由于 Thermo Sequenase 是含有 7 個(gè)額外氨基酸的 Taquenase，我們相信它也具有這種更高的熱穩(wěn)定性。
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